Principe de la microscopie à onde évanescente

La microscopie TIRF, ou microscopie à champ évanescent, est une forme de microscopie en fluorescence où la lumière d’excitation est confinée à une petite zone au niveau de l’interface entre l’échantillon et la lamelle en verre ou la cuve de culture. La technique TIRF permet l’imagerie de molécules isolées à l’échelle nanométrique.
De nombreux processus cellulaires font intervenir la membrane plasmique des cellules : la formation et la stabilisation de zones d’adhérence, le trafic de récepteurs membranaires, la fusion de vésicules ou leur bourgeonnement, ou encore le recrutement de protéines sur la membrane plasmique. Ces phénomènes peuvent bien sûr être étudiés par microscopie confocale, mais bien vite se pose la question de savoir si le marqueur observé se trouve bien à proximité de la membrane, ou sur la membrane.
Un système à onde évanescente, appelée aussi microscopie TIRF (pour Total Internal Reflection Fluorescence) peut permettre de clarifier ces problèmes, et aussi apporter des gains importants en matière de résolution axiale, de vitesse d’acquisition et de limitation de la cytotoxicité de l’illumination.

Le TIRF repose sur le principe suivant:

Lorsque la lumière passant d’un milieu à indice de réfraction élevé (par exemple, du verre) à un milieu à indice de réfraction plus faible (par exemple, de l’eau ou des cellules) heurte l’interface entre ces milieux à un angle d’incidence suffisamment faible, il lui est impossible de se propager dans le second matériau et elle est ainsi réfléchie dans le premier.
Cependant, la lumière réfléchie pénètre dans le second milieu (cellules) à une profondeur de seulement quelques centaines de nanomètres et elle diminue de manière exponentielle avec la distance. L’excitation des fluorophores a donc lieu dans une zone dont l’épaisseur est typiquement inférieure à 200 nm. En confinant l’énergie d’excitation dans cette section mince, on obtient un haut rapport signal-bruit, et il devient possible d’observer la fluorescence des molécules individuelles.

De la réfraction à le réflexion totale interne

(A) Lorsqu’un faisceau de lumière polarisée monochromatique (laser) illumine une interface entre deux milieux d’indice de réfraction différent  (par exemple, l’interface entre une lamelle de verre et une cellule), une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l’interface et l’autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface.

(B) Selon l’angle d’incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. En condition de réflexion totale, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l’onde évanescente, se propage perpendiculairement à l’interface avec une intensité qui décroît exponentiellement avec la distance à l’interface.

On peut ainsi en TIRFM visualiser et étudier de manière très sélective avec une très grande résolution la morphologie ou les évènements intervenant à la membrane plasmique de cellules vivantes.

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