Applications et Services

CONTACTS:

• Cécile TOURREL-CUZIN: cecile.tourrel-cuzin@univ-paris-diderot.fr

• Blandine GAUSSERES: blandine.gausseres@univ-paris-diderot.fr

Toutes les techniques de cytométrie en flux sont réalisables dans la mesure où les lasers et la configuration des filtres optiques du cytomètre sont compatibles avec les fluorochromes utilisés.

PRINCIPALES APPLICATIONS:

1/ l’analyse des constituants cellulaires:

ADN (étude du cycle cellulaire, viabilité, prolifération…)

ARN

protéines

Phénotypage: expression d’antigènes membranaires et/ou intracellulaires.

2/ l’analyse de fonctions cellulaires:

Flux ioniques (Calcium…)

modification du pH

variation du potentiel membranaire ou mitochondrial

apoptose (mesure Annexine V/Iodure de propidium)

cytokines et activités enzymatiques.

3/ l’analyse de cellules transfectées

EGFP

mCherry…

Toutes ces mesures peuvent être associées entre elles et dans certains cas accompagnées d’un tri cellulaire.

La liste ci-dessus n’est pas une liste exhaustive : nous pouvons vous aider à élaborer des protocoles de recherche (choix des fluorochromes, conditions de tri et traitement des échantillons triés).

QUELQUES EXEMPLES D’APPLICATIONS

1. Tri de cellules beta pancréatiques primaires

• Tri de cellules beta-pancréatiques primaires de rat par cytométrie en se basant leur taille (FSC) et leur auto-fluorescence (F1), après élimination des doublets de cellules (Fig. A).

• Vérification de la pureté du tri par immuno-fluorescence après marquage des cellules avec des anticorps anti-insuline-RhodamineX et anti-glucagon-Alexa488 (Fig. B).

• Vérification de la fonctionnalité des cellules triées par dosage de l’insuline sécrétée en réponse à une concentration basale (5.5 mM) et stimulante en glucose (16.7 mM) (Fig. C).

2. Analyse de la viabilité de cellules beta pancréatiques par marquage au 7-AAD

• Cellules beta pancréatiques primaires de rat marquées au 7-AAD (7-Amino-Actinomycin), marqueur de viabilité cellulaire qui s’intercalent dans la double hélice d’ADN.

Les cellules sont incubées pendant 10 min à raison de 0.1 µg de 7-AAD pour un million de cellules.

3. Analyse de la mort cellulaire et de l’apoptose

3.1/ Analyse de l’apoptose et de la mort cellulaire sur cellules INS-1
par co-marquage à l’Annexine V-FITC et à l’Iodure de Propidium (PI).

• Cellules INS-1 (lignée de cellules beta pancréatiques de rat) productrices d’insuline d’insuline, non traitées (Fig. A, B, C, D) ou traitées avec un inducteur d’apoptose, la Thapsigargine à 100 nM (Fig. E) ou 500 nM (Fig. F).

V: Viable Cells, EA: Early Apoptotic Cells, LA: Late Apoptotic Cells, D: Dead Cells.

3.2/ Analyse de l’apoptose et de la mort cellulaire de PBMC
par co-marquage à l’Annexine V-FITC et à l’Iodure de Propidium (PI).

• Cellules Mononuclées du Sang Périphérique (PBMC) non traitées (Fig. A, B, C, D) ou traitées avec un inducteur d’apoptose, la Thapsigargine à 10 µM pendant 4H (Fig. E).

V: Viable Cells, EA: Early Apoptotic Cells, LA: Late Apoptotic Cells, D: Dead Cells.